تحسين تغذية المفاعل الحيوي في ثقافة خلايا الثدييات

لماذا يهمّ التحكم في التغذية في مزارع خلايا CHO

تُنتَج البروتينات العلاجية في الصناعة الدوائية في الغالب ضمن مزارع خلايا مبيض الهامستر الصيني (CHO) التي تُغذّى بالغلوكوز [1]. وفي نمط التغذية الدفعية المعتاد، يُضاف الغلوكوز على شكل جرعة كبيرة في نقاط زمنية محددة تُختار بناءً على المعرفة المسبقة بالعملية والتحليل خارج الخط؛ ويصف Esmonde-White وآخرون هذه الممارسة بأنها كثيفة العمالة والموارد، ويشيرون إلى أن أخذ العينات يزيد خطر التلوث، ويخلصون إلى أنها لا تضبط الغلوكوز واللاكتات ضبطًا كافيًا [1]. وتكتسب اللاكتات أهميتها لأن تراكمها كثيرًا ما يضعف أداء المزرعة وإنتاج البروتين العلاجي [2]. ويوفّر إرشاد PAT الصادر عن FDA عام 2004 الإطار التنظيمي: نظام لتصميم التصنيع وتحليله والتحكم فيه من خلال قياسات آنية للسمات الحرجة للجودة والأداء الخاصة بالمواد الخام والمواد قيد المعالجة والعمليات [3]. والمطيافية في الموقع هي المرشّح البديهي لمثل هذه القياسات، غير أن اختيار التقنية ليس أمرًا محايدًا.

لماذا تمثّل NIR تحديًا في أوساط الاستزراع

امتصاصات الأشعة تحت الحمراء القريبة هي نغمات توافقية وتركيبات لاهتزازات أساسية لروابط C–H وN–H وO–H؛ والنطاقات عريضة ومتداخلة بشدة، وفي العمليات المغمورة يهيمن الوجود الطاغي للماء على الطيف، إذ تُغطّى المنطقة المحيطة بـ 1450 nm بالكامل بالنغمة التوافقية الأولى لـ O–H [4]. ويوجد الغلوكوز واللاكتات والغلوتامين والأمونيا بمستويات تُقاس بالغرام لكل لتر أو بالمليمول فوق خلفية الماء هذه، وإلى جانب مكونات كثيرة أخرى في الوسط.

ومع ذلك يمكن تحقيق ذلك. فقد وضع Arnold وآخرون مسبارًا ليفيًا بصريًا لـ NIR في الموقع قابلًا للتعقيم بالبخار في مزرعة CHO-K1، وبنوا نماذج للغلوكوز واللاكتات والغلوتامين والأمونيا بأخطاء معيارية للتنبؤ بلغت 0.072 g/L و0.0144 g/L و0.308 mM و0.036 mM على التوالي؛ واستخدمت المعايرة مجموعات بيانات كبيرة بحيث يُشمل كل تباين محتمل في التكافؤ الكيميائي [5]. وحدّد Rhiel وآخرون مشكلة ثانية أدق: أثناء الاستزراع تتغير المواد المحللة معًا، لأن الأيض يستهلك المغذيات وينتج نواتج ثانوية، ومن ثم قد تتعلم معايرة مبنية على عينات المزرعة هذا التغاير بدلًا من المادة المحللة نفسها [6]. وقد أزالت معايرتهم التكيفية التغاير الناجم عن الأيض، واستخدمت منطقة التركيب 4800–4200 cm^-1، وبلغت أخطاء معيارية للتنبؤ قدرها 0.82 mM للغلوكوز و0.94 mM للاكتات في وسط غير مخفف قائم على المصل، مع القياس خارج الخط [6].

أين تُستخدم مطيافية رامان والأشعة تحت الحمراء المتوسطة

أفاد Abu-Absi وآخرون بالجدوى التقنية لمسبار رامان مضمَّن في الخط داخل مفاعل حيوي لمزارع خلايا الثدييات، يتنبأ في آن واحد بالغلوتامين والغلوتامات والغلوكوز واللاكتات والأمونيوم وكثافة الخلايا الحية وكثافة الخلايا الكلية [7]. ولأن NADH والفلافينات في خلايا CHO تُظهر تألقًا ذاتيًا في المجال المرئي، تُشغَّل مطيافية رامان في العمليات الحيوية بإثارة في الأشعة تحت الحمراء القريبة عند 785 أو 830 nm [1]. ومنذ ذلك الحين استُخدمت مطيافية رامان لإغلاق حلقة التغذية. فقد بنى Berry وآخرون نموذج PLS للغلوكوز من دراسات الإضافة القياسية وثماني دفعات معايرة على النطاق المختبري، وغذّوا الغلوكوز حسب الطلب؛ وأدى الحفاظ على الغلوكوز عند هدف ثابت منخفض إلى خفض غلكزة المنتج من نحو 9 % إلى 4 %، في حين أن هدفًا متناقصًا على مراحل لم يخفضها مقارنة بالتغذية بالجرعات [8]. أما Matthews وآخرون فلم يغذّوا الغلوكوز إلا عندما كانت اللاكتات المتنبأ بها بمطيافية رامان دون نقطة ضبط (4.0 أو 2.5 g/L) وكان الغلوكوز دون 0.5 g/L؛ وبلغ RMSEP لنماذج PLS لديهم 0.27 g/L للغلوكوز و0.20 g/L للاكتات، وارتفعت مدة الاستزراع من 11 إلى 13 يومًا، وزاد العيار عند الحصاد بنسبة 85 % مقارنة بالعملية التاريخية [2]. وهذه نتائج تخص عمليات وسلالات خلوية بعينها، وليست توقعات عامة.

تقيس الأشعة تحت الحمراء المتوسطة الاهتزازات الأساسية لا النغمات التوافقية. وقد راقب Rhiel وآخرون الغلوكوز واللاكتات في الموقع في مزارع CHO داخل المفاعلات الحيوية بنماذج PLS طُبّقت دون تغيير بعد 2.3 سنة، بأخطاء معيارية للتقدير تراوحت بين 1 و3 mM للاكتات؛ وأظهر نموذج الغلوكوز إزاحة ثابتة تعيّن ضبطها قبل التلقيح، وتطلّب الكاشف تعبئة يومية بالنيتروجين السائل [9]. وتدرج المراجعات الخاصة بمراقبة مزارع خلايا الثدييات كلًا من NIR والأشعة تحت الحمراء المتوسطة والتألق ثنائي الأبعاد والسعة العازلة ضمن التقنيات في الموقع التي اختُبرت بالفعل، وتعتمد كل منها على طرائق كيمومترية مثل PCR أو PLS أو الشبكات العصبية لاستخلاص المعلومات [10].

من التنبؤ إلى التحكم في التغذية

أيًّا كانت التقنية، لا يتحول الطيف إلى قرار تغذية إلا عبر نموذج كيمومتري، وتتعامل أدبيات المراجعة مع اختيار الأطوال الموجية والمعالجة المسبقة وتحليل المكونات الرئيسية وPLS بوصفها الخطوات الأساسية [11]. وتترتب على الدراسات السابقة ثلاث نقاط عملية:

• صمّموا المعايرة بحيث تكسر التغاير الأيضي. تمنح تجارب الإضافة القياسية والدفعات المشغّلة عمدًا على مدى واسع من التراكيز النموذجَ تباينًا مستقلًا في المادة المحللة المستهدفة [6][8].
• حدّدوا منطق التحكم قبل النموذج. تحدد قاعدة التغذية أي مادة محللة يجب التنبؤ بها وعند أي مستوى؛ فقد احتاج Matthews وآخرون إلى التنبؤ بكل من الغلوكوز واللاكتات لتقييد التغذية [2].
• تحقّقوا من الصلاحية للاستخدام المقصود. يقدّم ASTM E2898 نهجًا قائمًا على المخاطر للتحقق من صلاحية الطرائق التحليلية لتطبيقات PAT، بحيث يتناسب جهد التحقق مع الدور الذي يؤديه التنبؤ في التحكم [12].

نهج USTECH

تتركز مساهمة USTECH في مراقبة المفاعلات الحيوية على جانب البيانات. إذ توفر حزمة الكيمومتريات caliX أدوات PCA وPLS الموصوفة أعلاه لبيانات أطياف NIR وFTIR ورامان [11]. أما ما إذا كانت تقنية ونموذج معيّنان يبلغان الدقة التي تحتاجها استراتيجية تغذية ما، فيُحسم في دراسة جدوى باستخدام عيناتكم وتحاليلكم المرجعية، مع التحقق من الصلاحية وفق ASTM E2898 [12].