Memeli Hücre Kültüründe Biyoreaktör Besleme Optimizasyonu

CHO kültüründe besleme kontrolü neden önemlidir

Terapötik proteinler ilaç sektöründe büyük ölçüde glukozla beslenen Çin hamsteri yumurtalık (CHO) hücre kültürlerinde üretilir [1]. Yaygın beslemeli kesikli işletimde glukoz, önceki proses bilgisi ve hat dışı analizlere göre seçilen belirli zamanlarda büyük bir bolus halinde verilir; Esmonde-White ve ark. bu uygulamayı emek ve kaynak yoğun olarak nitelendirir, numune almanın kontaminasyon riskini artırdığını belirtir ve glukoz ile laktatı yeterince kontrol etmediği sonucuna varır [1]. Laktat önemlidir, çünkü birikmesi çoğu zaman kültür performansını ve terapötik proteinin üretimini olumsuz etkiler [2]. FDA'nın 2004 tarihli PAT kılavuzu düzenleyici çerçeveyi sağlar: hammaddelerin, proses içi malzemelerin ve proseslerin kritik kalite ve performans niteliklerinin zamanında ölçülmesi yoluyla üretimi tasarlamaya, analiz etmeye ve kontrol etmeye yönelik bir sistem [3]. Yerinde spektroskopi bu tür ölçümler için akla ilk gelen adaydır, ancak teknik seçimi tarafsız bir karar değildir.

NIR kültür ortamlarında neden zorlayıcıdır

Yakın kızılötesi absorpsiyonlar C–H, N–H ve O–H temel titreşimlerinin üst tonları ve kombinasyonlarıdır; bantlar geniştir ve güçlü biçimde örtüşür, batık proseslerde ise spektruma suyun ezici varlığı hâkimdir ve 1450 nm civarındaki bölge birinci O–H üst tonu tarafından tamamen örtülür [4]. Glukoz, laktat, glutamin ve amonyak bu su arka planının üzerinde, gram/litre ya da milimolar düzeylerde ve pek çok başka ortam bileşeninin yanında bulunur.

Yine de yapılabilir. Arnold ve ark., bir CHO-K1 kültürüne buharla sterilize edilebilen yerinde fiber optik bir NIR probu yerleştirmiş ve glukoz, laktat, glutamin ve amonyak için sırasıyla 0,072 g/L, 0,0144 g/L, 0,308 mM ve 0,036 mM tahmin standart hatalı modeller kurmuştur; kalibrasyonda, stokiyometrideki olası tüm varyasyonu kapsayacak şekilde büyük veri setleri kullanılmıştır [5]. Rhiel ve ark. ikinci ve daha ince bir sorunu ortaya koymuştur: kültivasyon sırasında analitler birlikte değişir, çünkü metabolizma besinleri tüketip yan ürünler üretir; bu yüzden kültür numuneleri üzerine kurulan bir kalibrasyon analitin kendisini değil bu kovaryansı öğrenebilir [6]. Geliştirdikleri uyarlamalı kalibrasyon metabolizmanın yol açtığı kovaryansı ortadan kaldırmış, 4800–4200 cm^-1 kombinasyon bölgesini kullanmış ve seyreltilmemiş, serum içeren ortamda hat dışı ölçümle glukoz için 0,82 mM, laktat için 0,94 mM tahmin standart hatasına ulaşmıştır [6].

Raman ve orta kızılötesi nerede kullanılır

Abu-Absi ve ark., bir memeli hücre kültürü biyoreaktöründe hat içi Raman probunun teknik olarak uygulanabilirliğini bildirmiş; glutamin, glutamat, glukoz, laktat, amonyum, canlı hücre yoğunluğu ve toplam hücre yoğunluğunu eş zamanlı olarak tahmin etmiştir [7]. CHO hücrelerindeki NADH ve flavinler görünür bölgede otofloresans verdiğinden biyoproses Raman ölçümleri 785 veya 830 nm'de yakın kızılötesi uyarımla yapılır [1]. Raman o zamandan beri besleme döngüsünü kapatmak için kullanılmaktadır. Berry ve ark., ekleme (spiking) çalışmaları ve sekiz tezgâh ölçekli kalibrasyon partisinden bir PLS glukoz modeli kurmuş ve glukozu talebe göre beslemiştir; glukozu düşük ve sabit bir hedefte tutmak ürün glikasyonunu yaklaşık %9'dan %4'e indirmiş, kademeli olarak düşen bir hedef ise bolus beslemeye kıyasla glikasyonu azaltmamıştır [8]. Matthews ve ark. glukozu yalnızca Raman ile tahmin edilen laktat bir ayar noktasının (4,0 veya 2,5 g/L) ve glukoz 0,5 g/L'nin altındayken beslemiştir; PLS modellerinin RMSEP değerleri glukoz için 0,27 g/L, laktat için 0,20 g/L olmuş, kültür süresi 11 günden 13 güne çıkmış ve hasat titresi geçmiş prosese göre %85 artmıştır [2]. Bunlar belirli prosesler ve hücre hatlarına ait sonuçlardır, genel beklentiler değildir.

Orta kızılötesi, üst tonları değil temel titreşimleri ölçer. Rhiel ve ark., CHO biyoreaktör kültürlerinde glukoz ve laktatı yerinde, 2,3 yıl sonra değiştirilmeden uygulanan PLS modelleriyle izlemiş ve laktat için 1 ila 3 mM tahmin standart hataları elde etmiştir; glukoz modelinde aşılamadan önce düzeltilmesi gereken sabit bir sapma görülmüş, dedektör ise her gün sıvı azot doldurulmasını gerektirmiştir [9]. Memeli hücre kültürü izleme üzerine derlemeler; NIR, orta kızılötesi, 2B floresans ve dielektrik kapasitansı daha önce denenmiş yerinde teknikler arasında sayar ve her birinin bilgiyi çıkarmak için PCR, PLS veya yapay sinir ağları gibi kemometrik yöntemlere dayandığını belirtir [10].

Tahminden besleme kontrolüne

Teknik ne olursa olsun spektrum ancak bir kemometrik model aracılığıyla besleme kararına dönüşür; derleme literatürü dalga boyu seçimini, ön işlemeyi, temel bileşen analizini ve PLS'yi temel adımlar olarak ele alır [11]. Yukarıdaki çalışmalardan üç pratik nokta çıkar:

• Kalibrasyonu metabolik kovaryansı kıracak şekilde tasarlayın. Ekleme deneyleri ve bilerek geniş bir derişim aralığında yürütülen partiler, modele hedef analitte bağımsız varyasyon sağlar [6][8].
• Kontrol mantığına modelden önce karar verin. Besleme kuralı hangi analitin hangi düzeyde tahmin edilmesi gerektiğini belirler; Matthews ve ark. beslemeyi kısıtlamak için hem glukoz hem de laktat tahminine ihtiyaç duymuştur [2].
• Amaçlanan kullanım için doğrulayın. ASTM E2898, PAT uygulamalarına yönelik analitik yöntemlerin doğrulanmasında risk temelli bir yaklaşım sunar; böylece doğrulama çabası, tahminin kontrolde üstlendiği rolle orantılı olur [12].

USTECH'in yaklaşımı

USTECH'in biyoreaktör izlemeye katkısı veri tarafındadır. caliX kemometri paketi, NIR, FTIR ve Raman spektral verileri için yukarıda anlatılan PCA ve PLS araçlarını sunar [11]. Belirli bir teknik ve modelin bir besleme stratejisinin gerektirdiği doğruluğa ulaşıp ulaşmadığı, kendi numuneleriniz ve referans analizlerinizle yürütülen ve ASTM E2898 doğrultusunda doğrulanan bir fizibilite çalışmasında belirlenir [12].