Optimización de la alimentación del biorreactor en cultivo de células de mamíferos

Por qué importa el control de la alimentación en el cultivo CHO

En la industria farmacéutica, las proteínas terapéuticas se producen en gran medida en cultivos de células de ovario de hámster chino (CHO) alimentados con glucosa [1]. En el modo fed-batch habitual, la glucosa se añade en forma de grandes bolos en momentos fijos, elegidos a partir del conocimiento previo del proceso y de análisis fuera de línea; Esmonde-White et al. describen esta práctica como intensiva en mano de obra y recursos, señalan que el muestreo aumenta el riesgo de contaminación y concluyen que no controla adecuadamente la glucosa ni el lactato [1]. El lactato es relevante porque su acumulación suele perjudicar el rendimiento del cultivo y la producción de la proteína terapéutica [2]. La guía PAT de la FDA de 2004 aporta el marco regulatorio: un sistema para diseñar, analizar y controlar la fabricación mediante mediciones oportunas de los atributos críticos de calidad y rendimiento de las materias primas, los materiales en proceso y los procesos [3]. La espectroscopía in situ es la candidata evidente para tales mediciones, pero la elección de la técnica no es neutra.

Por qué la NIR es exigente en medios de cultivo

Las absorciones en el infrarrojo cercano son sobretonos y combinaciones de las vibraciones fundamentales C–H, N–H y O–H; las bandas son anchas y se solapan fuertemente, y en los procesos sumergidos el espectro está dominado por la abrumadora presencia del agua, con la región en torno a 1450 nm completamente cubierta por el primer sobretono O–H [4]. La glucosa, el lactato, la glutamina y el amoníaco se encuentran en niveles de gramos por litro o milimolares sobre ese fondo de agua y junto a muchos otros componentes del medio.

Aun así, es posible. Arnold et al. instalaron una sonda NIR de fibra óptica in situ esterilizable con vapor en un cultivo CHO-K1 y construyeron modelos para glucosa, lactato, glutamina y amoníaco con errores estándar de predicción de 0,072 g/L, 0,0144 g/L, 0,308 mM y 0,036 mM, respectivamente; la calibración utilizó grandes conjuntos de datos para incluir toda la variación probable de la estequiometría [5]. Rhiel et al. identificaron un segundo problema, más sutil: durante un cultivo los analitos varían conjuntamente, porque el metabolismo consume nutrientes y genera subproductos, de modo que una calibración construida con muestras de cultivo puede aprender esa covarianza en lugar del propio analito [6]. Su calibración adaptativa eliminó la covarianza inducida por el metabolismo, utilizó la región de combinación de 4800–4200 cm^-1 y alcanzó errores estándar de predicción de 0,82 mM para la glucosa y 0,94 mM para el lactato en medio con suero sin diluir, medido fuera de línea [6].

Dónde se utilizan el Raman y el infrarrojo medio

Abu-Absi et al. demostraron la viabilidad técnica de una sonda Raman en línea en un biorreactor de cultivo de células de mamífero, con la que predijeron simultáneamente glutamina, glutamato, glucosa, lactato, amonio, densidad de células viables y densidad celular total [7]. Dado que el NADH y las flavinas de las células CHO presentan autofluorescencia en el visible, el Raman en bioprocesos se realiza con excitación en el infrarrojo cercano a 785 u 830 nm [1]. Desde entonces, el Raman se ha utilizado para cerrar el lazo de alimentación. Berry et al. construyeron un modelo PLS de glucosa a partir de estudios de adición y de ocho lotes de calibración a escala de laboratorio y alimentaron glucosa según la demanda; mantener la glucosa en un objetivo bajo y constante redujo la glicación del producto de aproximadamente el 9 % al 4 %, mientras que un objetivo decreciente por etapas no la redujo con respecto a la alimentación en bolo [8]. Matthews et al. alimentaron glucosa solo cuando el lactato predicho por Raman estaba por debajo de un valor de consigna (4,0 o 2,5 g/L) y la glucosa por debajo de 0,5 g/L; sus modelos PLS tuvieron un RMSEP de 0,27 g/L para la glucosa y de 0,20 g/L para el lactato, la duración del cultivo pasó de 11 a 13 días y el título en cosecha aumentó un 85 % respecto al proceso histórico [2]. Son resultados de procesos y líneas celulares concretos, no expectativas generales.

El infrarrojo medio mide vibraciones fundamentales en lugar de sobretonos. Rhiel et al. monitorizaron in situ la glucosa y el lactato en cultivos CHO en biorreactor con modelos PLS que se aplicaron sin cambios al cabo de 2,3 años, con errores estándar de estimación de 1 a 3 mM para el lactato; el modelo de glucosa mostró un desplazamiento constante que tuvo que ajustarse antes de la inoculación, y el detector requería rellenarse diariamente con nitrógeno líquido [9]. Las revisiones sobre la monitorización de cultivos de células de mamífero incluyen NIR, infrarrojo medio, fluorescencia 2D y capacitancia dieléctrica entre las técnicas in situ ya ensayadas, todas ellas dependientes de métodos quimiométricos como PCR, PLS o redes neuronales para extraer la información [10].

De la predicción al control de la alimentación

Sea cual sea la técnica, el espectro solo se convierte en una decisión de alimentación a través de un modelo quimiométrico, y la literatura de revisión considera la selección de longitudes de onda, el preprocesamiento, el análisis de componentes principales y la PLS como los pasos fundamentales [11]. De los estudios anteriores se desprenden tres puntos prácticos:

• Diseñe la calibración para romper la covarianza metabólica. Los experimentos de adición y los lotes conducidos deliberadamente en un amplio intervalo de concentraciones aportan al modelo una variación independiente del analito objetivo [6][8].
• Defina la lógica de control antes que el modelo. La regla de alimentación determina qué analito debe predecirse y en qué nivel; Matthews et al. necesitaron predicciones tanto de glucosa como de lactato para restringir la alimentación [2].
• Valide para el uso previsto. ASTM E2898 ofrece un enfoque basado en el riesgo para validar métodos analíticos en aplicaciones PAT, de modo que el esfuerzo de validación corresponda al papel que la predicción desempeña en el control [12].

El enfoque de USTECH

La contribución de USTECH a la monitorización de biorreactores se sitúa en el lado de los datos. El paquete quimiométrico caliX proporciona las herramientas de PCA y PLS descritas anteriormente para datos espectrales NIR, FTIR y Raman [11]. Si una técnica y un modelo determinados alcanzan la exactitud que requiere una estrategia de alimentación se establece en un estudio de viabilidad con sus propias muestras y análisis de referencia, validado conforme a ASTM E2898 [12].