Optimierung der Bioreaktorfütterung in der Zellkultur von Säugetieren

Warum die Zufütterungsregelung in der CHO-Kultur wichtig ist

Therapeutische Proteine werden in der pharmazeutischen Industrie überwiegend in Zellkulturen aus Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) hergestellt, die mit Glucose gefüttert werden [1]. Im üblichen Fed-Batch-Betrieb wird Glucose als großer Bolus zu festen Zeitpunkten zugegeben, die auf Grundlage von Prozesswissen und Offline-Analysen festgelegt werden; Esmonde-White et al. beschreiben diese Praxis als arbeits- und ressourcenintensiv, weisen darauf hin, dass die Probenahme das Kontaminationsrisiko erhöht, und kommen zu dem Schluss, dass Glucose und Lactat so nicht ausreichend geregelt werden [1]. Lactat ist entscheidend, weil seine Anreicherung die Kulturleistung und die Bildung des therapeutischen Proteins häufig beeinträchtigt [2]. Den regulatorischen Rahmen liefert die PAT-Leitlinie der FDA von 2004: ein System zur Auslegung, Analyse und Steuerung der Herstellung durch zeitnahe Messungen kritischer Qualitäts- und Leistungsmerkmale von Roh- und Zwischenmaterialien sowie Prozessen [3]. Die In-situ-Spektroskopie bietet sich für solche Messungen an, doch die Wahl der Technik ist nicht neutral.

Warum NIR in Kulturmedien anspruchsvoll ist

Absorptionen im Nahinfrarot sind Oberton- und Kombinationsschwingungen der C–H-, N–H- und O–H-Grundschwingungen; die Banden sind breit und stark überlagert, und in Submersprozessen wird das Spektrum von der überwältigenden Präsenz des Wassers beherrscht, wobei der Bereich um 1450 nm vom ersten O–H-Oberton vollständig überdeckt wird [4]. Glucose, Lactat, Glutamin und Ammoniak liegen in Konzentrationen von Gramm pro Liter oder im millimolaren Bereich auf diesem Wasserhintergrund und neben vielen weiteren Mediumbestandteilen vor.

Möglich ist es dennoch. Arnold et al. setzten eine dampfsterilisierbare faseroptische In-situ-NIR-Sonde in eine CHO-K1-Kultur ein und erstellten Modelle für Glucose, Lactat, Glutamin und Ammoniak mit Standardvorhersagefehlern von 0,072 g/L, 0,0144 g/L, 0,308 mM bzw. 0,036 mM; für die Kalibrierung wurden große Datensätze verwendet, damit alle wahrscheinlichen Schwankungen der Stöchiometrie erfasst waren [5]. Rhiel et al. erkannten ein zweites, subtileres Problem: Während einer Kultivierung verändern sich die Analyten gemeinsam, weil der Stoffwechsel Nährstoffe verbraucht und Nebenprodukte bildet, sodass eine an Kulturproben erstellte Kalibrierung diese Kovarianz statt des Analyten selbst lernen kann [6]. Ihre adaptive Kalibrierung beseitigte die stoffwechselbedingte Kovarianz, nutzte den Kombinationsbereich von 4800–4200 cm^-1 und erreichte in unverdünntem serumhaltigem Medium, offline gemessen, Standardvorhersagefehler von 0,82 mM für Glucose und 0,94 mM für Lactat [6].

Wo Raman und Mittelinfrarot eingesetzt werden

Abu-Absi et al. belegten die technische Machbarkeit einer Inline-Raman-Sonde in einem Bioreaktor mit Säugerzellkultur, mit der Glutamin, Glutamat, Glucose, Lactat, Ammonium, Lebendzelldichte und Gesamtzelldichte gleichzeitig vorhergesagt wurden [7]. Da NADH und Flavine in CHO-Zellen im sichtbaren Bereich autofluoreszieren, wird Bioprozess-Raman mit Nahinfrarot-Anregung bei 785 oder 830 nm betrieben [1]. Inzwischen wird Raman auch genutzt, um den Fütterungsregelkreis zu schließen. Berry et al. erstellten aus Aufstockungsversuchen und acht Kalibrierchargen im Labormaßstab ein PLS-Glucosemodell und fütterten Glucose bedarfsgerecht zu; ein niedriger, konstanter Glucose-Sollwert senkte die Produktglykierung von etwa 9 % auf 4 %, während ein stufenweise sinkender Sollwert sie gegenüber der Bolusfütterung nicht verringerte [8]. Matthews et al. fütterten Glucose nur zu, wenn das per Raman vorhergesagte Lactat unter einem Sollwert (4,0 oder 2,5 g/L) und Glucose unter 0,5 g/L lag; ihre PLS-Modelle erreichten einen RMSEP von 0,27 g/L für Glucose und 0,20 g/L für Lactat, die Kulturdauer stieg von 11 auf 13 Tage, und der Ernte-Titer lag um 85 % über dem des bisherigen Prozesses [2]. Dies sind Ergebnisse für bestimmte Prozesse und Zelllinien, keine allgemeinen Erwartungswerte.

Das Mittelinfrarot erfasst Grundschwingungen statt Obertöne. Rhiel et al. überwachten Glucose und Lactat in situ in CHO-Bioreaktorkulturen mit PLS-Modellen, die nach 2,3 Jahren unverändert angewendet wurden, mit Standardschätzfehlern von 1 bis 3 mM für Lactat; das Glucosemodell zeigte einen konstanten Offset, der vor der Inokulation angepasst werden musste, und der Detektor musste täglich mit flüssigem Stickstoff befüllt werden [9]. Übersichtsarbeiten zur Überwachung von Säugerzellkulturen nennen NIR, Mittelinfrarot, 2D-Fluoreszenz und dielektrische Kapazität unter den bereits erprobten In-situ-Techniken, die alle auf chemometrische Verfahren wie PCR, PLS oder neuronale Netze angewiesen sind, um die Information zu gewinnen [10].

Von der Vorhersage zur Zufütterungsregelung

Unabhängig von der Technik wird ein Spektrum erst über ein chemometrisches Modell zu einer Fütterungsentscheidung, und die Übersichtsliteratur behandelt Wellenlängenauswahl, Vorverarbeitung, Hauptkomponentenanalyse und PLS als Kernschritte [11]. Aus den genannten Studien ergeben sich drei praktische Punkte:

• Kalibrierung so auslegen, dass die metabolische Kovarianz aufgebrochen wird. Aufstockungsversuche und gezielt über einen weiten Konzentrationsbereich gefahrene Chargen geben dem Modell eine unabhängige Variation des Zielanalyten [6][8].
• Regelungslogik vor dem Modell festlegen. Die Fütterungsregel bestimmt, welcher Analyt in welchem Bereich vorhergesagt werden muss; Matthews et al. benötigten Vorhersagen sowohl für Glucose als auch für Lactat, um die Fütterung zu begrenzen [2].
• Für den vorgesehenen Zweck validieren. ASTM E2898 beschreibt einen risikobasierten Ansatz zur Validierung analytischer Methoden für PAT-Anwendungen, sodass der Validierungsaufwand der Rolle der Vorhersage in der Regelung entspricht [12].

Der Ansatz von USTECH

Der Beitrag von USTECH zur Bioreaktorüberwachung liegt auf der Datenseite. Die Chemometrie-Suite caliX stellt die oben beschriebenen PCA- und PLS-Werkzeuge für NIR-, FTIR- und Raman-Spektraldaten bereit [11]. Ob eine bestimmte Technik und ein bestimmtes Modell die Genauigkeit erreichen, die eine Fütterungsstrategie erfordert, wird in einer Machbarkeitsstudie mit Ihren eigenen Proben und Referenzanalysen ermittelt und gemäß ASTM E2898 validiert [12].