为什么 CHO 培养中的补料控制至关重要
制药行业中的治疗性蛋白主要由以葡萄糖补料的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞培养生产[1]。在常规补料分批模式下，葡萄糖按照依据既往工艺知识和离线分析选定的时间点大剂量一次性加入；Esmonde-White 等认为这种做法耗费人力和资源，指出取样会增加污染风险，并得出结论：它不能充分控制葡萄糖和乳酸[1]。乳酸之所以重要，是因为其积累往往会损害培养表现和治疗性蛋白的生产[2]。FDA 2004 年的 PAT 指南提供了监管框架：通过对原料、中间物料及工艺的关键质量和性能属性进行及时测量，来设计、分析和控制生产的体系[3]。原位光谱是此类测量的当然之选，但技术的选择并非无关紧要。
为什么 NIR 在培养基中颇具挑战
近红外吸收是 C–H、N–H 和 O–H 基频振动的倍频和合频；谱带宽且严重重叠，而在液体深层工艺中，光谱被占绝对优势的水所主导，1450 nm 附近区域完全被 O–H 一级倍频覆盖[4]。葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和氨的含量仅为克每升或毫摩尔级，叠加在这一水背景之上，并与培养基中的许多其他组分共存。
尽管如此，这仍然可以实现。Arnold 等在 CHO-K1 培养中安装了可蒸汽灭菌的原位光纤 NIR 探头，建立了葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和氨的模型，预测标准误差分别为 0.072 g/L、0.0144 g/L、0.308 mM 和 0.036 mM；定标采用了大型数据集，以涵盖化学计量关系中所有可能的变化[5]。Rhiel 等指出了第二个更隐蔽的问题：培养过程中各分析物同时变化，因为代谢消耗营养物并产生副产物，因此基于培养样品建立的定标可能学到的是这种协变关系而非分析物本身[6]。他们的自适应定标消除了代谢引起的协变，采用 4800–4200 cm-1 合频区，在未稀释的含血清培养基中离线测量时，葡萄糖和乳酸的预测标准误差分别达到 0.82 mM 和 0.94 mM[6]。
拉曼和中红外的应用领域
Abu-Absi 等报道了在哺乳动物细胞培养生物反应器中使用在线拉曼探头的技术可行性，可同时预测谷氨酰胺、谷氨酸、葡萄糖、乳酸、铵、活细胞密度和总细胞密度[7]。由于 CHO 细胞中的 NADH 和黄素在可见光区产生自发荧光，生物过程拉曼采用 785 或 830 nm 的近红外激发[1]。此后，拉曼已被用于闭合补料回路。Berry 等利用加标研究和八个实验室规模定标批次建立了葡萄糖 PLS 模型，并按需补加葡萄糖；将葡萄糖维持在较低的恒定目标值使产物糖基化从约 9 % 降至 4 %，而逐级降低的目标值与大剂量补料相比并未使其降低[8]。Matthews 等仅在拉曼预测的乳酸低于设定值（4.0 或 2.5 g/L）且葡萄糖低于 0.5 g/L 时补加葡萄糖；其 PLS 模型对葡萄糖和乳酸的 RMSEP 分别为 0.27 g/L 和 0.20 g/L，培养周期由 11 天延长至 13 天，收获滴度较历史工艺提高 85 %[2]。这些是针对特定工艺和细胞系的结果，而非普遍预期。
中红外测量的是基频振动而非倍频。Rhiel 等在 CHO 生物反应器培养中利用 PLS 模型原位监测葡萄糖和乳酸，模型在 2.3 年后未经修改仍可使用，乳酸的估计标准误差为 1 至 3 mM；葡萄糖模型存在恒定偏移，须在接种前校正，且检测器需要每日加注液氮[9]。关于哺乳动物细胞培养监测的综述将 NIR、中红外、二维荧光和介电电容列为已经测试过的原位技术，每种技术都依赖 PCR、PLS 或神经网络等化学计量学方法来提取信息[10]。
从预测到补料控制
无论采用何种技术，光谱都只有通过化学计量学模型才能转化为补料决策，综述文献将波长选择、预处理、主成分分析和 PLS 视为核心步骤[11]。由上述研究可以得出三点实践要点：
- 设计定标时要打破代谢协变。加标实验以及有意在宽浓度范围内运行的批次，可使模型获得目标分析物的独立变化[6][8]。
- 先确定控制逻辑，再建立模型。补料规则决定了必须预测哪种分析物以及在什么水平上预测；Matthews 等需要同时预测葡萄糖和乳酸才能限制补料[2]。
- 针对预期用途进行验证。ASTM E2898 为 PAT 应用中分析方法的验证提供了基于风险的方法，使验证工作量与预测在控制中所起的作用相匹配[12]。
USTECH 的做法
USTECH 对生物反应器监测的贡献在于数据方面。caliX 化学计量学软件套件为 NIR、FTIR 和拉曼光谱数据提供上述 PCA 和 PLS 工具[11]。某一技术和模型能否达到补料策略所需的准确度，需要用您自己的样品和参考分析开展可行性研究来确定，并按照 ASTM E2898 进行验证[12]。
参考文献
- [1] Esmonde-White, K.A., Cuellar, M., Uerpmann, C., Lenain, B., Lewis, I.R. (2017). Raman spectroscopy as a process analytical technology for pharmaceutical manufacturing and bioprocessing. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 409(3), 637–649. doi:10.1007/s00216-016-9824-1
- [2] Matthews, T.E., Berry, B.N., Smelko, J., Moretto, J., Moore, B., Wiltberger, K. (2016). Closed loop control of lactate concentration in mammalian cell culture by Raman spectroscopy leads to improved cell density, viability, and biopharmaceutical protein production. Biotechnology and Bioengineering, 113(11), 2416–2424. doi:10.1002/bit.26018
- [3] U.S. Food and Drug Administration (2004). Guidance for Industry: PAT — A Framework for Innovative Pharmaceutical Development, Manufacturing, and Quality Assurance. CDER, CVM and ORA, Rockville, MD. fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/pat-framework-innovative-pharmaceutical-development-manufacturing-and-quality-assurance
- [4] Tamburini, E., Marchetti, M., Pedrini, P. (2014). Monitoring key parameters in bioprocesses using near-infrared technology. Sensors, 14(10), 18941–18959. doi:10.3390/s141018941
- [5] Arnold, S.A., Crowley, J., Woods, N., Harvey, L.M., McNeil, B. (2003). In-situ near infrared spectroscopy to monitor key analytes in mammalian cell cultivation. Biotechnology and Bioengineering, 84(1), 13–19. doi:10.1002/bit.10738
- [6] Rhiel, M., Cohen, M.B., Murhammer, D.W., Arnold, M.A. (2002). Nondestructive near-infrared spectroscopic measurement of multiple analytes in undiluted samples of serum-based cell culture media. Biotechnology and Bioengineering, 77(1), 73–82. doi:10.1002/bit.10093
- [7] Abu-Absi, N.R., Kenty, B.M., Cuellar, M.E., Borys, M.C., Sakhamuri, S., Strachan, D.J., Hausladen, M.C., Li, Z.J. (2011). Real time monitoring of multiple parameters in mammalian cell culture bioreactors using an in-line Raman spectroscopy probe. Biotechnology and Bioengineering, 108(5), 1215–1221. doi:10.1002/bit.23023
- [8] Berry, B.N., Dobrowsky, T.M., Timson, R.C., Kshirsagar, R., Ryll, T., Wiltberger, K. (2016). Quick generation of Raman spectroscopy based in-process glucose control to influence biopharmaceutical protein product quality during mammalian cell culture. Biotechnology Progress, 32(1), 224–234. doi:10.1002/btpr.2205
- [9] Rhiel, M., Ducommun, P., Bolzonella, I., Marison, I., von Stockar, U. (2002). Real-time in situ monitoring of freely suspended and immobilized cell cultures based on mid-infrared spectroscopic measurements. Biotechnology and Bioengineering, 77(2), 174–185. doi:10.1002/bit.10134
- [10] Teixeira, A.P., Oliveira, R., Alves, P.M., Carrondo, M.J.T. (2009). Advances in on-line monitoring and control of mammalian cell cultures: Supporting the PAT initiative. Biotechnology Advances, 27(6), 726–732. doi:10.1016/j.biotechadv.2009.05.003
- [11] Lourenço, N.D., Lopes, J.A., Almeida, C.F., Sarraguça, M.C., Pinheiro, H.M. (2012). Bioreactor monitoring with spectroscopy and chemometrics: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 404(4), 1211–1237. doi:10.1007/s00216-012-6073-9
- [12] ASTM E2898-20a. Standard Guide for Risk-Based Validation of Analytical Methods for PAT Applications. ASTM International, West Conshohocken, PA. store.astm.org/e2898-20a.html
