Optimisation de l’alimentation des bioréacteurs dans la culture de cellules de mammifères

Pourquoi le contrôle de l'alimentation compte en culture CHO

Dans l'industrie pharmaceutique, les protéines thérapeutiques sont en grande partie produites dans des cultures de cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO) alimentées en glucose [1]. En mode fed-batch classique, le glucose est apporté en bolus importants à des instants fixés d'après la connaissance antérieure du procédé et des analyses hors ligne ; Esmonde-White et al. décrivent cette pratique comme exigeante en main-d'œuvre et en ressources, notent que l'échantillonnage accroît le risque de contamination et concluent qu'elle ne contrôle pas correctement le glucose et le lactate [1]. Le lactate importe parce que son accumulation dégrade souvent les performances de la culture et la production de la protéine thérapeutique [2]. Le guide PAT de la FDA de 2004 fournit le cadre réglementaire : un système de conception, d'analyse et de contrôle de la fabrication fondé sur la mesure en temps utile des attributs critiques de qualité et de performance des matières premières, des matériaux en cours de fabrication et des procédés [3]. La spectroscopie in situ est la candidate naturelle pour de telles mesures, mais le choix de la technique n'est pas neutre.

Pourquoi le NIR est délicat dans les milieux de culture

Les absorptions proche infrarouge sont des harmoniques et des combinaisons des vibrations fondamentales C–H, N–H et O–H ; les bandes sont larges et fortement superposées, et dans les procédés en immersion le spectre est dominé par la présence écrasante de l'eau, la région autour de 1450 nm étant entièrement masquée par la première harmonique O–H [4]. Le glucose, le lactate, la glutamine et l'ammoniac se situent à des niveaux de l'ordre du gramme par litre ou du millimolaire, au-dessus de ce fond d'eau et aux côtés de nombreux autres composants du milieu.

C'est néanmoins faisable. Arnold et al. ont placé une sonde NIR à fibre optique in situ stérilisable à la vapeur dans une culture CHO-K1 et construit des modèles pour le glucose, le lactate, la glutamine et l'ammoniac avec des erreurs standard de prédiction de 0,072 g/L, 0,0144 g/L, 0,308 mM et 0,036 mM respectivement ; l'étalonnage reposait sur de grands jeux de données afin d'inclure toutes les variations probables de stœchiométrie [5]. Rhiel et al. ont mis en évidence un second problème, plus subtil : au cours d'une culture, les analytes varient ensemble, car le métabolisme consomme les nutriments et produit des sous-produits, si bien qu'un étalonnage construit sur des échantillons de culture peut apprendre cette covariance plutôt que l'analyte lui-même [6]. Leur étalonnage adaptatif a supprimé la covariance induite par le métabolisme, utilisé la région de combinaison 4800–4200 cm^-1 et atteint des erreurs standard de prédiction de 0,82 mM pour le glucose et de 0,94 mM pour le lactate dans un milieu sérique non dilué, mesuré hors ligne [6].

Où le Raman et le moyen infrarouge sont utilisés

Abu-Absi et al. ont démontré la faisabilité technique d'une sonde Raman en ligne dans un bioréacteur de culture de cellules de mammifères, prédisant simultanément la glutamine, le glutamate, le glucose, le lactate, l'ammonium, la densité de cellules viables et la densité cellulaire totale [7]. Comme le NADH et les flavines des cellules CHO présentent une autofluorescence dans le visible, le Raman en bioprocédé utilise une excitation proche infrarouge à 785 ou 830 nm [1]. Le Raman a depuis servi à fermer la boucle d'alimentation. Berry et al. ont construit un modèle PLS du glucose à partir d'études d'ajouts dosés et de huit lots d'étalonnage à l'échelle du laboratoire et ont alimenté le glucose à la demande ; maintenir le glucose à une consigne basse et constante a réduit la glycation du produit d'environ 9 % à 4 %, alors qu'une consigne décroissant par paliers ne l'a pas réduite par rapport à l'alimentation en bolus [8]. Matthews et al. n'ont alimenté le glucose que lorsque le lactate prédit par Raman était inférieur à une consigne (4,0 ou 2,5 g/L) et le glucose inférieur à 0,5 g/L ; leurs modèles PLS présentaient un RMSEP de 0,27 g/L pour le glucose et de 0,20 g/L pour le lactate, la durée de culture est passée de 11 à 13 jours et le titre à la récolte a augmenté de 85 % par rapport au procédé historique [2]. Il s'agit de résultats obtenus pour des procédés et des lignées cellulaires précis, non d'attentes générales.

Le moyen infrarouge mesure les vibrations fondamentales plutôt que les harmoniques. Rhiel et al. ont suivi in situ le glucose et le lactate dans des cultures CHO en bioréacteur à l'aide de modèles PLS appliqués sans modification après 2,3 ans, avec des erreurs standard d'estimation de 1 à 3 mM pour le lactate ; le modèle du glucose présentait un décalage constant à corriger avant l'inoculation, et le détecteur nécessitait un remplissage quotidien en azote liquide [9]. Les revues consacrées au suivi des cultures de cellules de mammifères citent le NIR, le moyen infrarouge, la fluorescence 2D et la capacitance diélectrique parmi les techniques in situ déjà testées, chacune s'appuyant sur des méthodes chimiométriques telles que la PCR, la PLS ou les réseaux de neurones pour extraire l'information [10].

De la prédiction à la régulation de l'alimentation

Quelle que soit la technique, le spectre ne devient une décision d'alimentation qu'au travers d'un modèle chimiométrique, et la littérature de synthèse considère la sélection des longueurs d'onde, le prétraitement, l'analyse en composantes principales et la PLS comme les étapes essentielles [11]. Trois points pratiques découlent des études ci-dessus :

• Concevoir l'étalonnage pour rompre la covariance métabolique. Des expériences d'ajouts dosés et des lots volontairement conduits sur une large plage de concentrations donnent au modèle une variation indépendante de l'analyte cible [6][8].
• Définir la logique de régulation avant le modèle. La règle d'alimentation détermine quel analyte doit être prédit et à quel niveau ; Matthews et al. avaient besoin des prédictions du glucose et du lactate pour restreindre l'alimentation [2].
• Valider pour l'usage prévu. L'ASTM E2898 propose une approche fondée sur le risque pour la validation des méthodes analytiques destinées aux applications PAT, afin que l'effort de validation corresponde au rôle que joue la prédiction dans la régulation [12].

L'approche d'USTECH

La contribution d'USTECH au suivi des bioréacteurs se situe du côté des données. La suite de chimiométrie caliX fournit les outils PCA et PLS décrits ci-dessus pour les données spectrales NIR, FTIR et Raman [11]. Qu'une technique et un modèle donnés atteignent l'exactitude requise par une stratégie d'alimentation est établi par une étude de faisabilité sur vos propres échantillons et analyses de référence, validée conformément à l'ASTM E2898 [12].