So funktioniert die NIR-Kalibrierung: PLS erklärt

Warum ein Spektrum eine Kalibrierung braucht

Ein Nahinfrarotspektrometer zeichnet die Absorbanz bei vielen Wellenlängen auf, doch keine einzelne Wellenlänge ist spezifisch für Protein, Fett oder Feuchte: Die Messungen sind nicht selektiv, und die Information über einen Bestandteil verteilt sich auf viele Kanäle. Die multivariate Kalibrierung ist die Familie von Methoden, die aus solchen nicht selektiven Daten quantitative Information gewinnt, indem sie viele Kanäle zugleich kombiniert; dadurch lassen sich auch ungewöhnliche Proben als Ausreißer kennzeichnen [1]. ASTM E1655 legt Verfahren für die multivariate Kalibrierung von Infrarotspektrometern sowohl im Nahinfrarot (etwa 780 bis 2500 nm) als auch im Mittelinfrarot fest, einschließlich Kriterien zur Validierung der Leistungsfähigkeit einer Kalibrierung [2]. Dieser Leitfaden erklärt ohne Gleichungen, wie die Partial-Least-Squares-Regression (PLS) — die zentrale Methode der Standardwerke zur Kalibrierung [1][3] — in Anwendungen etwa der Lebensmittel- und Futtermittelindustrie funktioniert und wie ihre Leistungsfähigkeit beurteilt wird.

Was PLS tut: latente Variablen

Der naheliegende Ansatz, eine gewöhnliche multiple lineare Regression über alle Wellenlängen, scheitert, weil Spektren weit mehr Variablen enthalten, als Kalibrierproben vorhanden sind, und benachbarte Wellenlängen stark miteinander korreliert sind. Das Tutorial von Geladi und Kowalski legt diese Schwächen konventioneller Regressionsverfahren dar und stellt PLS als Ausweg vor [4]. Wold et al. beschreiben die PLS-Regression als lineares Modell, das die Spektrenmatrix X mit den Referenzwerten Y verknüpft und dabei zugleich die Struktur innerhalb von X modelliert, und führen ihren Nutzen auf die Fähigkeit zurück, viele verrauschte, kollineare und sogar unvollständige Variablen zu verarbeiten [5].

In der Praxis verdichtet PLS jedes Spektrum zu einer kleinen Zahl von Scores auf latenten Variablen, auch Faktoren oder Komponenten genannt. Jede latente Variable ist eine gewichtete Kombination aller Wellenlängen, so gewählt, dass sie systematische spektrale Variation beschreibt, die zugleich mit dem Referenzwert zusammenhängt; die Zusammensetzung wird dann aus diesen wenigen Scores statt aus Hunderten roher Absorbanzwerte vorhergesagt [4][5]. Haaland und Thomas zeigten, wie PLS mit der klassischen und der inversen Methode der kleinsten Quadrate sowie der Hauptkomponentenregression zusammenhängt und dass sich chemisch interpretierbare spektrale Information aus den Zwischenschritten des Algorithmus ablesen lässt, und zwar direkter als bei der Hauptkomponentenregression [6].

Wie viele Faktoren?

Jeder zusätzliche Faktor lässt das Modell seine eigenen Kalibrierproben genauer abbilden, doch ab einem bestimmten Punkt beschreiben die zusätzlichen Faktoren Rauschen und probenspezifische Details statt Chemie. Gowen et al. fassen die Folge zusammen: Zu wenige latente Variablen führen zu Unteranpassung, zu viele zu Überanpassung, und beides verschlechtert die Leistung bei künftigen Proben; ein anerkanntes Zeichen der Überanpassung ist ein verrauschter Regressionsvektor mit scharfen, oszillierenden Spitzen [7]. Die Zahl der Faktoren wird daher anhand des Vorhersagefehlers an Proben gewählt, die nicht zur Modellanpassung verwendet wurden, per Kreuzvalidierung oder separatem Testdatensatz, ergänzt durch die Betrachtung der Regressionskoeffizienten [1][7]. Bereits Haaland und Thomas beschrieben Verfahren zur Wahl der optimalen Faktorenzahl, um eine Überanpassung an die Kalibrierdaten zu begrenzen [6].

Kalibrierung, Validierung und die Fehlerstatistiken

Üblicherweise werden drei mittlere quadratische Fehler (Root Mean Square Errors) angegeben [3]. RMSEC ist der Fehler an den Kalibrierproben selbst und stets zu optimistisch. RMSECV stammt aus der Kreuzvalidierung, bei der jede Probe (oder jedes Probensegment) von einem ohne sie erstellten Modell vorhergesagt wird. RMSEP ist der Fehler an einem unabhängigen Validierungsdatensatz aus Proben, die an der Modellbildung nicht beteiligt waren, und die beste Schätzung der Leistung im Routinebetrieb. ISO 12099, die Leitlinie für die NIR-Analyse von Futtermitteln und Getreide, enthält gesonderte Abschnitte zu Kalibrierung und Erstvalidierung sowie zu Statistiken für die Leistungsbewertung, darunter Bias, Standardfehler der Vorhersage (SEP) und Steigung [8]. Westad und Marini warnen, dass die zufällige Aufteilung eines Datensatzes in Kalibrier- und Testteil nur gerechtfertigt ist, wenn die Proben keine systematische Struktur aufweisen; wird die Validierung über Wiederholbarkeits-, Vergleichbarkeits-, Geräte- und Rohstoffvariation hinweg durchgeführt, können sich sowohl die Fehlerwerte als auch die Zahl der Faktoren ändern [9]. Drei praktische Konsequenzen:

• An wirklich neuen Proben validieren. Testproben sollten aus anderen Chargen, Jahreszeiten oder von anderen Lieferanten stammen als der Kalibrierdatensatz, damit die Validierung die Variation widerspiegelt, der der Analysator im Einsatz begegnet [9].
• Im kalibrierten Bereich bleiben. Das Kalibrierverfahren legt den Bereich fest, in dem Vorhersagen gültig sind; Proben außerhalb dieses Bereichs oder als spektrale Ausreißer gekennzeichnete Proben sollten nicht als normale Ergebnisse gemeldet werden [1][2].
• Ein Modell nicht nach einer einzigen Kennzahl beurteilen. Zusammenfassende Verhältnisse wie der RPD (Standardabweichung der Referenzwerte geteilt durch den Vorhersagefehler) sind weit verbreitet, doch Esbensen et al. kritisieren das blinde Vertrauen in sie als allumfassendes Maß der Kalibrierqualität [10].

Die Referenzmethode setzt die Untergrenze

Eine Kalibrierung wird mit Werten einer Labor-Referenzmethode trainiert und geprüft, und diese Werte sind selbst fehlerbehaftet. Faber und Kowalski weisen darauf hin, dass der gegen gemessene Referenzwerte geschätzte Vorhersagefehler ein scheinbarer Fehler ist, der systematisch größer ausfällt als der wahre Vorhersagefehler, weil der Zufallsfehler der Referenzmessung von keinem Modell vorhergesagt werden kann und fälschlich als Unzulänglichkeit der Kalibrierung verbucht wird [11]. Der Zusammenhang ist subtiler als „NIR kann nie besser sein als die Referenz“: DiFoggio zählt diese Aussage zu den wiederkehrenden Fehlvorstellungen über die NIR-Analyse und nennt Gegenbeispiele [12]. Praktisch bedeutet dies, dass ein angegebener RMSEP nicht überzeugend unter der Wiederholbarkeit des Referenzlabors liegen kann; die Kenntnis dieser Wiederholbarkeit gehört daher zur Interpretation jedes Validierungsergebnisses [11][12].

Wie USTECH bei der Kalibrierung vorgeht

PLS-Modelle für USTECH-Analysatoren wie den ProLine2550 und den MasterLine17EC werden in der Chemometrie-Software caliX entwickelt und über ProChem in den Prozess überführt. Die spektrale Vorbehandlung behandeln die Leitfäden zu MSC und SNV und zur Savitzky-Golay-Filterung, den Software-Arbeitsablauf PLS-Regression in caliX. Die Validierung folgt den oben genannten Grundsätzen, mit unabhängigen Proben und den in ISO 12099 und ASTM E1655 definierten Statistiken [2][8]. Ob ein Parameter die Genauigkeit erreicht, die ein Prozess benötigt, wird in einer Machbarkeitsstudie mit Ihren eigenen Proben und Referenzanalysen ermittelt.