Cómo funciona la calibración NIR: PLS explicado

Por qué un espectro necesita una calibración

Un espectrómetro de infrarrojo cercano registra la absorbancia a muchas longitudes de onda, pero ninguna longitud de onda por sí sola es específica de la proteína, la grasa o la humedad: las medidas no son selectivas y la información sobre un componente está repartida en muchos canales. La calibración multivariante es la familia de métodos que extrae información cuantitativa de estos datos no selectivos combinando muchos canales a la vez, lo que además permite señalar como atípicas las muestras inusuales [1]. ASTM E1655 establece prácticas para la calibración multivariante de espectrómetros de infrarrojo tanto en el infrarrojo cercano (aproximadamente de 780 a 2500 nm) como en el infrarrojo medio, incluidos criterios para validar el rendimiento de una calibración [2]. Esta guía explica, sin ecuaciones, cómo funciona la regresión por mínimos cuadrados parciales (PLS) — el método central de los textos de referencia sobre calibración [1][3] — en aplicaciones como las de la industria de alimentos y piensos, y cómo se juzga su rendimiento.

Qué hace PLS: variables latentes

El enfoque obvio, una regresión lineal múltiple ordinaria sobre todas las longitudes de onda, fracasa porque los espectros contienen muchas más variables que muestras de calibración y las longitudes de onda vecinas están fuertemente correlacionadas entre sí. El tutorial de Geladi y Kowalski expone estas carencias de los métodos de regresión convencionales y presenta PLS como una forma de sortearlas [4]. Wold et al. describen la regresión PLS como un modelo lineal que relaciona la matriz espectral X con los valores de referencia Y a la vez que modela la estructura dentro de X, y atribuyen su utilidad a su capacidad para manejar muchas variables ruidosas, colineales e incluso incompletas [5].

En la práctica, PLS comprime cada espectro en un pequeño número de puntuaciones (scores) sobre variables latentes, también llamadas factores o componentes. Cada variable latente es una combinación ponderada de todas las longitudes de onda, elegida de modo que describa variación espectral sistemática que además está relacionada con el valor de referencia; la composición se predice después a partir de estas pocas puntuaciones y no de cientos de absorbancias brutas [4][5]. Haaland y Thomas mostraron cómo se relaciona PLS con los mínimos cuadrados clásicos, los mínimos cuadrados inversos y la regresión por componentes principales, y que puede leerse información espectral químicamente interpretable en los pasos intermedios del algoritmo, de forma más directa que en la regresión por componentes principales [6].

¿Cuántos factores?

Cada factor adicional hace que el modelo se ajuste más a sus propias muestras de calibración, pero a partir de cierto punto los factores adicionales describen ruido y detalles propios de cada muestra en lugar de química. Gowen et al. resumen la consecuencia: muy pocas variables latentes producen subajuste y demasiadas, sobreajuste, y ambos conducen a un rendimiento deficiente con muestras futuras; un signo reconocido de sobreajuste es un vector de regresión ruidoso con picos agudos y oscilantes [7]. Por ello, el número de factores se elige a partir del error de predicción en muestras no utilizadas para ajustar el modelo, mediante validación cruzada o un conjunto de prueba independiente, junto con la inspección de los coeficientes de regresión [1][7]. Haaland y Thomas ya describieron procedimientos para seleccionar el número óptimo de factores a fin de limitar el sobreajuste de los datos de calibración [6].

Calibración, validación y los estadísticos de error

Habitualmente se informan tres errores cuadráticos medios [3]. RMSEC es el error sobre las propias muestras de calibración y siempre es optimista. RMSECV procede de la validación cruzada, en la que cada muestra (o segmento de muestras) se predice con un modelo construido sin ella. RMSEP es el error sobre un conjunto de validación independiente de muestras que no intervinieron en la construcción del modelo, y es la mejor estimación del rendimiento en el uso rutinario. ISO 12099, la directriz para el análisis NIR de piensos y cereales, dedica apartados separados a la calibración y la validación inicial y a los estadísticos de medida del rendimiento, incluidos el sesgo, el error estándar de predicción (SEP) y la pendiente [8]. Westad y Marini advierten que dividir al azar un único conjunto de datos en partes de calibración y de prueba solo está justificado cuando no existe una estructura sistemática en las muestras; cuando la validación se realiza teniendo en cuenta la variación de repetibilidad, reproducibilidad, instrumento y materia prima, pueden cambiar tanto las cifras de error como el número de factores [9]. Tres consecuencias prácticas:

• Validar con muestras realmente nuevas. Las muestras de prueba deben proceder de lotes, temporadas o proveedores distintos de los del conjunto de calibración, para que la validación refleje la variación que el analizador encontrará en uso [9].
• Mantenerse dentro del intervalo calibrado. El procedimiento de calibración define el intervalo en el que las predicciones son válidas; las muestras fuera de él, o señaladas como espectros atípicos, no deben informarse como resultados normales [1][2].
• No juzgar un modelo por un único índice. Los cocientes resumen como el RPD (desviación estándar de los valores de referencia dividida por el error de predicción) se utilizan mucho, pero Esbensen et al. critican la confianza ciega en ellos como medida definitiva de la calidad de la calibración [10].

El método de referencia fija el suelo

Una calibración se entrena y se prueba frente a valores de un método de referencia de laboratorio, y esos valores tienen su propio error. Faber y Kowalski señalan que el error de predicción estimado frente a valores de referencia medidos es un error aparente, sistemáticamente mayor que el error de predicción real, porque el error aleatorio de la medida de referencia no puede predecirlo ningún modelo y se contabiliza erróneamente como una insuficiencia de la calibración [11]. La relación es más sutil que «el NIR nunca puede ser mejor que la referencia»: DiFoggio incluye esa afirmación entre los conceptos erróneos recurrentes sobre el análisis NIR y aporta contraejemplos [12]. En la práctica, significa que un RMSEP informado no puede situarse de forma convincente por debajo de la repetibilidad del laboratorio de referencia, por lo que conocer esa repetibilidad forma parte de la interpretación de cualquier resultado de validación [11][12].

Cómo aborda USTECH la calibración

Los modelos PLS para analizadores USTECH como el ProLine2550 y el MasterLine17EC se desarrollan en el software quimiométrico caliX y se implantan en el proceso mediante ProChem. El preprocesamiento espectral se trata en las guías sobre MSC y SNV y sobre el filtrado de Savitzky-Golay, y el flujo de trabajo del software en Regresión PLS en caliX. La validación sigue los principios anteriores, con muestras independientes y los estadísticos definidos en ISO 12099 y ASTM E1655 [2][8]. Si un parámetro alcanza la exactitud que necesita un proceso se establece en un estudio de viabilidad con sus propias muestras y análisis de referencia.